动粒,动粒微管名词解释

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前言

基于模块的质粒构建是一种利用模块化设计原理构建质粒的方法。质粒构建分为多个独立模块。每个模块执行特定的功能或维护特定的数组。通过重组这些模块，质粒可以快速、灵活地构建不同的功能和特性。

在我们的研究中，通过按照设计要求组合这些整合模块，可以构建具有染色体整合功能的质粒，并在转化裂殖酵母细胞时，将这些质粒引入细胞中并进行重组，发现这种现象导致其合并到目标站点中。实现目的基因的整合和表达。

启动子模块

我们选择了裂殖酵母研究中常用的7个启动子进行研究，分别是Pnmt1、Pnmt2、Pnmt41、Padh2、Padh81、Padh3和Purg1。

它包括一系列nmt启动子Pnmt4、Pnmt41和Pnmt5，广泛用于控制外部基因的表达，可以称为人工启动子。这些基因的来源是内源性nmt81启动子。这是基因。

与Pnmt7相比，Pnmt1的启动子活性较弱甚至更弱，因此这些启动子的转录水平可以通过培养基中硫胺素的添加或去除来控制。

硫胺素存在时表达受到抑制，硫胺素不存在时表达被诱导。Pnmt81通常用于过表达下游基因，例如pREP1质粒。

adh1启动子变体系列包括Padh1、Padh41和Padh81。其中，Padh1是从内源adh1基因的启动子区域获得的，而Padh41和Padh81是Padh1突变体，启动子活性较弱。

还有一个名为Purg1的urg1启动子，它是一种诱导型启动子，响应尿嘧啶而被激活。

FPtag-C用于GOIC末端标记、Tadh1+hph和Tadh1+BSD、hph和bsd以及来自II号染色体特定区域的LEU2的荧光蛋白模块。

“lys1”分别源自内源性lys1和arg1基因。

为了诱导重组，在打靶模块的中间放置了一个性内切酶位点FseI，并通过FseI消化将整合的质粒线性化，有效引导同源序列在体内重组。

确保FseI位点在整合质粒中是唯一的，并避免酶消化后对整合质粒进行多次切割，这可以最大限度地降低重组过程中的风险8我们有目的地选择具有碱基识别序列的FseI酶。危险。

FPtag-N模块

N端标记的第二个模块应该是FPtag模块，它包含一个荧光蛋白基因，后跟一个位于539;末端侧翼的接头序列。

带有FPcontrol-N模块和FLAG/HA标记的N模块的GOI

作为对照，可能需要使用属于VIIa组的模块作为N端FLAG/HA表位标签，或通过PCR构建另一种表达FPtag且不含GOI的菌株。

这些模块包含带有FLAG或HA表位序列的寡核苷酸引物。这些小的表位标签也可以通过寡核苷酸退火方法来制备。与IIIa组中的模块类似，VIIa组中的每个模块都包含一个FPtag，两侧是粘性末端“b”和“.”。d”。

金门反应的实用方案

我们强烈建议将每个模块元素稀释至20fmol/l的浓度。

注意力对于高效连接似乎非常重要。取每个模块1l，混匀于PCR管中，并用去离子水填充管，使总体积为16l。

添加2l10X连接酶缓冲液，然后添加05lT4DNA连接酶和15lBsaI，总体积为20l。将此管放入热循环仪中，您可以自动执行所有反应步骤。

金门反应基本上由两个主要的迭代步骤和随后的终止反应组成。第一步是用BsaI消化DNA，第二步是连接。总共重复这些步骤最多50次。

通过加热至50C10分钟，然后进行热灭活步骤，可以将样品保持在4至15C之间。

该样品可直接用于转化大肠杆菌，并可使用LB+Amp培养基上的菌落进行小规模制备，通常使用2l反应样品进行转化。

入门载体pCR-BluntII-TOPO整合了卡那霉素抗性基因，因此未反应的入门载体不会在LB+Amp培养基中生长，避免未反应的质粒污染集落。

在50个BsaI消化和连接循环中，一旦两个没有BsaI识别位点的粘性末端连接起来，这个位点就不能被重新消化，使得成功连接的克隆得以存活和积累。

为了确保正确克隆，所有模块必须按预期的正确顺序连接并克隆到包含AmpR基因的载体中。这可以通过NotI酶消化来证实。

对成功的质粒进行粟酒裂殖酵母转化，使用FseI酶将质粒线性化，选择合适的粟酒裂殖酵母宿主菌株，并使用乙酸锂根据标准方案进行DNA转化。

转化后，选择可以在含有适当抗生素的固体培养基或基本培养基上生长且无需适当补充物的稳定菌落。

当使用赖氨酸1或arg1靶向模块时，正确的转化体必须具有抗生素抗性和对赖氨酸或精氨酸的营养需求。

这可以使用不含赖氨酸或精氨酸的基本培养基进行测试。如果使用co2和z2，请执行菌落PCR来仔细检查消化的质粒是否已正确插入。

使用集成模块的集成示例

我们创建了一个包含Pnmt1启动子和co20靶向序列的整合质粒，以表达带有GFP的Cut7融合蛋白。

使用cut31基因的野生型和三个截短突变体作为GOIs进行总共0次GoldenGate反应。

将每个反应样品用于大肠杆菌转化，并选择一些在LB+Amp培养基中生长的菌落进行小规模制备，并用NotI酶消化质粒以检查连接是否成功。

连接成功的比例为11/1、1/1和2/3，表明使用这些材料的GoldenGate反应可以有效地生成正确的质粒。

三个GoldenGate样品转化后，在LB+Amp平板上观察到30-150个转化的大肠杆菌菌落，并从每个转化体中选择5个菌落进行质粒小量制备和NotI酶鉴定。

在这六个样品中，2、8和1分别显示整合质粒、和的正确连接。将正确连接的整合质粒用FseI酶切，线性化片段用于转化。表达mCherry-微管蛋白或GFP-微管蛋白的庞贝酵母细胞。

通过实验选择在选择性培养基上生长的稳定转化体进行菌落PCR，以测试是否发生了准确的整合。大多数整合事件都是准确有效的，该菌株的八个菌落中有七个呈阳性。

每个菌株的阳性菌落在丰富培养基中生长过夜，并使用广视野显微镜使用常规可视化进行显微镜观察。

lifeact-GFP信号的强度足够强，可以通过结构照明显微镜揭示单个肌动蛋白电缆的细节，并且使用Pnmt1驱动的lifeact-GFP肌动蛋白补丁可以使细胞水平对齐，并可以在垂直堆叠中可视化。

这些观察结果表明，Pnmt1在富含硫胺素的培养基中可视化体内肌动蛋白组织方面优于Pnmt41，并证明GoldenGate方法可以应用于本研究中提供的模块。

结论是

在这项研究中，我们成功构建了一种基于模块的质粒，用于裂殖酵母裂殖酵母中的染色体整合，并证明了模块化设计可以用于有效地操纵质粒结构，实现裂殖酵母裂殖酵母中的染色体整合。我做到了。

该质粒的设计具有高度可调性和灵活性，可以满足各种实验需求，我们的实验表明该质粒成功整合到裂殖酵母裂殖酵母的染色体中，整合效率高且稳定性好。

此外，该质粒具有低背景杂交率和细胞性，确保了整合过程的可靠性和生物安全性。

参考

[1]Doherty，“烟草蚀纹病49-kDa蛋白酶催化残基的表征”

[2]林恒，“中心粒蛋白Moa1在减数分裂I中实现聚集介导的单极结合”

[3]Dodgson，“细胞极性的控制需要将极性因子空间分离到不同的皮质簇中。”

[4]Kini，“裂殖酵母中leu1-32和ura4-294的高效靶向整合”

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